EK hücre kolonileri giemsa ile boyandığında farklılaşmamış koloniler koyu boyanırken, farklılaşan koloniler daha açık tonlarda boyandılar. Farklılaşmamış kolonilerin sınırları, çizgiyle çizilmiş gibi belirgin ve net olduğu halde, farklılaşmaya başlayan kolonilerin sınırları dağılan hücrelerden dolayı belli belirsiz bir görünüme sahipti. hedeflemekte. Besiyerine uygulanan büyüme fak­törü kombinasyonlarının, miktarlarının ve zaman­lamasının hesaplanması, hücrelerarası maddenin yerini alabilecek polimerik malzemeler ve üç bo­yutta doku gelişimini destekleyecek biyomateryal-ler ve matematiksel modellerin geliştirilmesi bu alanın sorumluluğunda. Amaç, tümüyle yapay bir ortamda hücrelere istenileni yaptırabilmek. TÜBİTAK CMBAE Transgen ve Deney Hayvan­ları Laboratuavrında 2004 yılında bir kök hücre biyomühendisliği çalışması gerçekleştirildi. Kültür ortamındaki hayvansal ürünler olabildiğince uzak­laştırılarak, besleyici tabakaların yerini alabilecek, olabildiğince sentetik bir kültür sistemi geliştiril­meye çalışıldı. Besleyici tabakalar yerine Üç boyut­lu fibröz bîr matris; serum yerine 'serum replace­ment' denilen sentetik bir çözelti kullanıldı. Öncelikle hücreler besleyici tabakaların üze­rinde altı farklı besiyerinde kültüre edildi. Popu-lasyon katlanma sayıları ve farklılaşmamış koloni­lerin oranına göre en iyi besiyeri tanımlandı. Kul­lanılan çözeltilerin hücrelerin çoğalmaları üzerine bir etkisi olmadığı, ancak Serum Replacement (SR) uygulanan deney gruplarında kolonilerin da­ha az oranda farklılaşmış fenotip gösterdiği tespit edildi. Böylelikle deneyin ilk aşamasında hücrele­re uygun bir kimyasal çevre hazırlanmış oldu. Deneyin ikinci aşamasında hücrelerin kültüre olduğu fiziksel çevre değiştirildi. Besleyici tabaka­ların üzerinden alınan EK hücreleri üç boyutlu fib­röz bir matris olan dokunmamış poliester fabrik-lerinin (NWPF) üzerine aktarıldılar. NWPF diskle-

EMBRIYONIK KÖK HÜCRELER

Hücrelerin daha sağlıklı ve farklılaşmadan ço­ğalmalarını sağlasa da hastalık tedavisinde kulla­nılacak insan EK hücrelerinin, hayvan hücreleri­nin üzerinde kültüre edilmesi riskli. Fare hücrele-rindeki retroviruslar EK hücrelerin genomlarında mutasyonlara yol açabilirler. Bunun önüne geç­mek için değişik tipte insan hücreleri besleyici ta­baka olarak denenmiş durumda. Örneğin, 2003 yılında İsrail'de yapılan bir çalışmada, insan EK hücreleri yeni doğan bebeklerin sünnet edilmiş dokularından elde edilen hücrelerin üzerinde uzun dönem kültüre edilebilmiş. Hücre kültüründe EK hücreleri kontrol etme­nin yolu, tanımlanmış bir mikroçevreden geçiyor. Besiyeri bileşenleri, kültür kabı yüzeyleri, hücrele­rin birbirleriyle komşulukları, bir hücrenin mikro-çevresini belirleyen koşulları oluşturuyor. Son yıl­larda hızla gelişen bir dal olan kök hücre biyomü-hendisliği, kök hücrelerin istenilen yönde farklıla-şıp çoğalmaları için mikroçevreler yapılandırmayı

Embriyonik kök (EK) hücreler hasar görmüş dokuların yenilenmesi için eşsiz birer hücre kay­nağıdır. Klinikte hasarlı dokuların yenilenmesi için aynı düzeyde farklılaşmış çok sayıda hücreye gereksinim duyulur. Teorik olarak EK hücreler sı­nırsızca bölünebildikleri için İstenilen sayıda hüc­reyi; vücuttaki hemen her çeşit hücreye dönüşe­bildikleri için de ihtiyaç duyulan tipte farklılaşmış hücre tiplerini oluşturabilirler. Ancak uygulamada durum farklıdır. Bu hücrelerin, kendileri gibi kök hücreler oluşturarak çoğalmalarını yani 'yenilen-me'lerini sağlamak zordur; çünkü EK hücre doğa­sı gereği başka hücrelere farklılaşmak ister. Fark­lılaşmanın önüne geçebilmek için EK hücreler fa­re embriyolarından yalıtılan fibroblastlar üzerinde kültür ortamına sokulurlar, Fare embriyonik fib-roblastları, saldıkları birtakım faktörlerle EK hüc­releri desteklerler. EK hücrelerin altında, kültür kaplarının yüzeyini tamamen kaplamış bu tek ta­bakalı hücre grubuna besleyici tabaka da denir.

EK hücre kolonilerinin faz-kontrast mikroskoptaki görüntüleri. Farklılaşmamış hücrelerin birbirleriyle etkileşimi daha kuvvetlidir. Bu hücrelerin meydana getirdiği kolo­nilerin sınırları, çizgiyle çizilmişçesine belirgin olur ve faz kontrast filtrede parlak gözükürler. Yapılan çalışmada besleyici tabakaların üzerinde kültüre edilen koloniler besiyeri birleşenlerine göre farklı morfolojiler gösterdiler. SR içeren besiyerlerindeki koloniler daha belirgin sınırlara sahip, daha yuvarlak ve pürüzlü yüzeyler gösterir­ken, serumla kültüre edilen besiyerlerindeki koloniler daha basık ve pürüzsüz bir görünüme sahipti.

BİLİM ve TEKNİK 58 Ağustos 2005

EK hücre kolonilerinin alkalin fosfataz aktiviteleri ( x 200). Farklılaşmamış EK hücreleri daha yüksek alkalin iosfataz aktivitesi göstererek daha koyu tonlarda boyandı-lar. Farklılaşan ve koloni yapılarını kaybedenler ise daha açık tonlarda boyanarak daha düşük alkalin fosfataz etkinliği gösterdiler.

ri Hacettepe Üniversitesi Biyomühendislik Bölü-mü'nden Prof. Dr. Menemşe Gümüşderelioğlu ve ekibi tarafından hazırlandı. Bu matrisin malzeme­si ameliyat İpliklerinde ve damar greftlerinde de kullanılan bir biyomateryaldi. En büyük avantajı geniş yüzey ve alan hacmine sahip olmasıydı. Böy­lelikle besleyici tabakalarla sadece petri yüzey alanında kültüre olan hücreler, NWPF diskleri kul­lanıldığında aynı büyüklükteki petrinin içinde çok daha geniş bir alanda kültüre oldular.

Fare EK hücreleri LIF (Lösemi Önleyici Faktör) kullanıldığında farklılaşmadan çoğalırlar. LIF insan EK hücreleri üzerinde bir etki göstermezken, bazı fare EK hücre hatlarında besleyici tabakanın yeri­ni alabilecek kadar güçlü bir etkiye sahiptir. Bu ça­lışmada model olarak fare EK hücre hattı R1 kul­lanıldı. Kullanılan matrislerin yüzeyine LIF sabit-lendi. Böylelikle hücrelerin daha geniş alanda da­ha fazla farklılaşmayı önleyici faktörle daha uzun süre kültüre edilmesi sağlandı. UF'in yüzeye sabit-

lenmiş formu hücrelerle daha uzun süre etkileşe-ceği için etkinliğinin artacağı düşünüldü. İlk denemeler çok heyecanlıydı. Hücrelerin böyle fibröz bir yapıda nasıl kolonize olacaklarını merak ediyorduk. İlk 48 saat içinde hücreleri fi­berler (lifler) arasında gözlemek kolay olmadı. İlerleyen günlerde matris üzerinde fiberlerin ara­sını kaplamış çok büyük hücre agregatları (toplu­lukları) gözlendi. Bu agregatları gözlemleyebil­mek için kültürasyon en geç 4. günün sonunda durduruldu. Hücrelerin farklılaşmaya mı başladık­larım yoksa kendilerini mi yeniledikleri merak ediliyordu. Önce giemsa boyasıyla koloni morfolo­jilerini incelendi, sonra SSEA-1'e karşı bağışıklık tepkisi ve alkalin fosfataz aktivitesine bakıldı. Son olarak da kolonilerin elektron mikroskobu görün­tülerini alındı. Bazı koloniler tripsinle matristen ayrıldı, besleyici hücre tabakalarının üzerine ekil­di ve hücrelerin eski ortamlarında nasıl davran­dıkları izlendi. Polimerik matris deneyleri iki kol­dan yürütüldü'. UF sabitlenmiş yüzeylere sahip NWPF disklerle, hidrolize edilmiş yüzeylere sahip NWPF diskleri üzerinde EK hücrelerin gelişimi ay­rı ayrı izlendi. Sonuçlar, LIF sabitlenmiş yüzeylerde EK hüc­relerin daha az farklılaştığını gösterdi. Hidrolize yüzeylerde kültüre edilen hücrelerin besiyerine LIF eklenmesi, farklılaşmaların önüne geçemedi. Çalışmanın en umut verici yanı fiber yüzeyindeki, immobilize (hareketsiz) formdaki LIF'in çalışma-siydi. Bu, kök hücre biyomühendisliği çalışmaları için yeni bir fikirdi. Bu çok pahalı faktörü besiye­rine sürekli dışarıdan eklemek yerine, matris yü­zeyine sabitlemenin EK hücre yenilenmesi için hem etkili hem de ekonomik bir yol olabileceği gösterilmiş oldu. Bu çalışma, ülkemizde embriyonik kök hücrele­rin farklı kültür koşullarında ve polimerik yapılar üzerinde kültürü ile yapılan ilk çalışma olduğu için önemliydi. Elde edilen sonuçlar, embriyonik kök hücrelerin farklılaştırmadan kültüre edilebilmele­ri için, daha iyi tanımlanmış ortamların geliştirile­bilmesine yönelik bundan sonraki çalışmalara ışık tutacak. Gaye Çetinkaya Doç. Dr. Sezen Arat TUBITAK-GMBAE Transgen ve Deney Hayvanları Laboratuvarı

EK hücreler fiberler arasında büyük hücre agregatları ( x40). Büyük hücre toplulukları, LİF sabitlenmiş yüzey­lerde yüksek alkalin fosfataz etkinliği gösterdiler.

EK hücre kolonisinin PET fiberleri arasındaki gö­rüntüsü (x 400).

PET fiberler arasındaki EK hücre kolonisinin SSEA-l'e karşı bağışıklık tepkisi (x 200).

Giemsa ile boyanmış EK hücre kolonilerinin PET fi­berleri arasındaki görüntüsü ( x 200).

EK hücre kolonisinin LIF sabitlenmiş yüzeylerdeki elektron mikroskobik görüntüsü.

Giemsa ile boyanmış EK hücre kolonisinin PET fi­berleri arasındaki görüntüsü ( x 400).

Ağustos 2005 59 BİLIM ve TEKNİK